13_11_fascettaA meno di non essere a nostra volta dei pittori, quando guardiamo un quadro non ci domandiamo come il suo autore sia riuscito a ottenere una certa tonalità o un certo effetto di luce, né tantomeno quali accorgimenti siano stati presi, ad esempio, per preparare tela e colori in modo che le tinte si conservino il più a lungo possibile.Nello stesso modo, guardando un’immagine scientifica, ci concentriamo sull’oggetto raffigurato e difficilmente pensiamo a tutti i problemi tecnici che sono stati risolti per realizzarla. Effettivamente, tecniche nuove escogitate per risolvere problemi presentati da tecniche vecchie possono portare a risultati non immediatamente distinguibili, per un occhio profano. È il caso del rapporto tra microscopia confocale e multifotone.

Della microscopia confocale abbiamo parlato varie volte (marzo 2002, settembre 2003, marzo 2005, febbraio 2009, giugno 2010). Come già ricordato, il microscopio confocale produce delle sezioni ottiche della luce emessa dai fluorocromi eccitati dal laser, selezionando singole “fette” del campione mediante l’esclusione – attraverso un’apertura confocale – della componente di luce emessa al di sopra e al di sotto del piano in analisi. Le sezioni possono poi venire montate digitalmente, conferendo alle micrografie notevole profondità di campo e tridimensionalità. La microscopia confocale presenta però un serio problema, di cui non abbiamo ancora parlato. Anche se non vengono visualizzate, le altre regioni del campione vengono comunque illuminate dalla luce emessa dai laser e i fluorocromi che vengono così eccitati, in risposta a quella eccitazione sprecano la loro – limitata – capacità di emettere luce. Si produce cioè il fenomeno del photobleaching (letteralmente: “scolorimento della luce”).

Nel tempo richiesto dalle varie scansioni, la fluorescenza va rapidamente decrescendo, cosicché non solo il campione può venire difficilmente riutilizzato, ma la stessa immagine può facilmente apparire artefatta o difettosa.
La microscopia multifotone, alla cui esistenza nel marzo 2005 avevamo solo accennato, ovvia a questo problema con un procedimento che permette di selezionare il piano focale a partire dalla stessa eccitazione dei fluorocromi: anziché selezionare una sezione della luce emessa da tutti i fluorocromi contenuti nel campione, viene eccitato ogni volta solo un piano del campione.

Questa tecnica si basa su un principio fisico scoperto all’inizio degli anni ’30: l’assorbimento a due fotoni. In certe condizioni, due o più fotoni a bassa energia possono interagire con gli atomi di una molecola come se fossero un fotone solo a un’energia più alta.
Per venire applicato alla microscopia in fluorescenza, questo principio dovette attendere l’inizio degli anni ’90 e la messa a punto di particolari laser a luce infrarossa che emettono cicli di impulsi ultracorti. I fotoni a bassa energia vengono focalizzati su un singolo piano e vi eccitano solo le molecole che li ricevono a coppie (cosa che non avviene fuori dal piano di focalizzazione).

Oggi la microscopia a due fotoni permette di penetrare nei campioni istologici fino a un millimetro di profondità, restituendo immagini sempre più precise della disposizione delle cellule. Ma non è certo completamente scevra di problemi, che altre tecniche proveranno a risolvere.

 

Micrografia al microscopio a due fotoni di un tessuto renale di topo, preparato con DAPI (blu), AlexaFluor488 (verde), e AlexaFluor568 (rosso). Immagine realizzata presso i laboratori Thorlabs, utilizzando il loro microscopio multifotone e un obbiettivo Olympus 20X, 1.0 NA.

Micrografia al microscopio a due fotoni di un tessuto renale di topo, preparato con DAPI (blu), AlexaFluor488 (verde), e AlexaFluor568 (rosso). Immagine realizzata presso i laboratori Thorlabs, utilizzando il loro microscopio multifotone e un obbiettivo Olympus 20X, 1.0 NA.

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